噬菌體篩選技術(shù)可以展示大量不同的多肽或蛋白質(zhì),這種豐富的多樣性為篩選提供了廣闊的空間,有助于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分子的各種可能的特定結(jié)合配體或功能,大大增加了找到理想候選者的概率。即便相互作用較弱,噬菌體展示技術(shù)也能有效地進(jìn)行篩選。這意味著即使是低親和力的結(jié)合也能被檢測(cè)到,從而提高了對(duì)目標(biāo)的識(shí)別靈敏度,使得一些原本難以察覺(jué)的結(jié)合事件得以發(fā)現(xiàn)。
單輪篩選就能處理高達(dá)10PFU的噬菌體庫(kù),能夠快速地從海量的噬菌體中富集到具有特殊性質(zhì)的特異分子,提高了篩選效率,節(jié)省時(shí)間和資源。絲狀噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中,通過(guò)簡(jiǎn)單的離心加沉淀的方法就可以實(shí)現(xiàn)富集,無(wú)需復(fù)雜的蛋白純化步驟,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程,降低了操作難度和成本。可以獲得天然表位的替代分子,有效解決了“天然表位難以表達(dá)”的問(wèn)題,拓寬了研究和應(yīng)用的范圍,為獲取具有特定功能的分子提供了新的途徑。
噬菌體篩選是一種重要的生物技術(shù)手段,以下是其測(cè)定步驟:
1.準(zhǔn)備階段
-構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù):從B淋巴細(xì)胞中提取mRNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體的可變區(qū),將這些可變區(qū)基因克隆到噬菌體載體中,轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌,產(chǎn)生展示各種抗體的噬菌體。
-質(zhì)量控制:對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢查,包括確認(rèn)文庫(kù)的多樣性、插入率和庫(kù)容量。同時(shí),準(zhǔn)備足夠的目標(biāo)抗原,可以是純化的蛋白質(zhì)、肽段或固定在固相表面上的細(xì)胞。
2.篩選過(guò)程
-吸附(Binding):將噬菌體展示文庫(kù)與固相抗原孵育,使特異性抗體與抗原結(jié)合,未結(jié)合的噬菌體則被洗去。
-洗脫(Elution):使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ绺?jìng)爭(zhēng)性配體、改變pH值或特定洗脫劑,從固相表面洗脫結(jié)合的噬菌體。
-擴(kuò)增(Amplification):將洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)菌,以指數(shù)方式擴(kuò)增結(jié)合的噬菌體。一般在細(xì)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后收集并準(zhǔn)備下一輪篩選。
3.多輪篩選
-為提高抗體的特異性和親和力,通常需進(jìn)行多輪篩選。每輪篩選后對(duì)噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增,以便進(jìn)行下一輪更嚴(yán)格的篩選。隨著輪次增加,非特異性結(jié)合的噬菌體會(huì)逐漸被淘汰,而特異性結(jié)合的噬菌體將被富集。
4.鑒定和驗(yàn)證
-篩選結(jié)束后,對(duì)富集的噬菌體進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。通常涉及對(duì)噬菌體DNA進(jìn)行測(cè)序,確定抗體基因的序列;還可在體外表達(dá)這些抗體,并使用ELISA、Western blot等生物學(xué)方法驗(yàn)證其特異性和親和力。
5.親和力成熟(可選)
-若需要進(jìn)一步提高抗體性能,可進(jìn)行親和力成熟操作,如通過(guò)定向進(jìn)化、隨機(jī)突變或使用酵母表面展示等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。