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質粒DNA提取實驗

在我們的細胞實驗中經常會用到質粒DNA，那么具體是怎么來的呢？今天講的是DNA的提取步驟。前提：細菌繁殖步驟（挑單克隆，置于LB培養基中，置于37℃恒溫搖床搖過夜，180-200rpm）。一般市面上有很多試劑盒可供大家使用，大體步驟都差不多的啦~~我按照我所使用的試劑盒（AxyPrep中抽試劑盒）的步驟分享如下：收集1.50ml離心管收集過夜搖菌的LB培養液（此時可以做一下判斷，如果液體未變渾濁，說明細菌并未繁殖成功，這樣肯定難以提出DNA；如果液體渾濁，便說明細菌繁殖成功啦...

常見問題之蛋白在真核細胞的表達量低？

實際上真核生物的蛋白也可以用真核細胞蛋白表達系統來實現，而且效果往往更好。用原核生物來表達主要還是因為操作簡單，快速。如果希望表達和純化的蛋白性質穩定，經原核系統表達之后仍然有正確的折疊構象，那么使用原核表達系統就很合適了。有的時候在不同的表達體系里面對蛋白的表達量是有影響的。當構建完成后攜帶有信號肽的時候，一些蛋白在真核表達體系中表達量極低。去除信號肽序列值后，直接表達成熟肽，表達水平明顯提高。所以說構建的真核表達載體高表達mRNA卻檢測不到目的蛋白是*有可能的。

常見問題之影響蛋白表達因素有哪些？

1.蛋白本身的特性：蛋白分子量大小、蛋白來源/物種、是否為毒性蛋白，蛋白翻譯后修飾程度、蛋白自身結構的復雜程度2.宿主的選擇：宿主本身的特性、蛋白表達需求等都影響著蛋白表達3.蛋白需求量：蛋白應用范圍對應的需求量不同，所以要根據需求量確定表達系統4.質粒載體的選擇：載體是攜帶外源基因的工具，要根據系統選擇合適的載體才能使蛋白更好的表達5.融合標簽的選擇：蛋白重組表達過程中采用親和標簽融合表達有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋...

常見問題之HIS標簽蛋白沒有被洗脫下來

蛋白掛柱后洗脫不下來主要是因為蛋白和柱子結合能力太強或者洗脫條件太溫和，我們可以從以下幾方面考慮解決問題。1、洗脫條件太溫和：重新摸索洗脫條件，增加緩沖液中咪唑濃度或者適當降低緩沖液pH以確定最佳的洗脫條件或者更、換緩沖液的成分（換成tris-HCl緩沖液）。2、蛋白在柱子中沉淀：適當降低上樣量或蛋白濃度，用咪唑線性洗脫。使用添加劑或者改變NaCl的濃度，或者在變性的條件下洗脫（加4-8M的尿素或者4-6M的鹽酸胍）。3、非特異性的疏水或者其他作用：在洗脫液中加非離子的添加劑...

慢病毒構建原理

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉錄酶將外源基因整合到基因組中實現穩定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。◆慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小...

帶你學會一種藥物研究利器——等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年來發展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續、準確地監測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。ITC檢測方式與化學反應中的酸堿滴定法相似，在ITC測定中，首先將一種反應物置于一個溫控樣品池中，并通過一個熱電偶回路與一個參比池相偶聯，樣品池和參比池處于相同的外部環境。特定的滴定劑（按實驗需要選擇）定...

NK細胞是屬于什么細胞呢？

NK（自然殺傷細胞）通過整合識別MHCI分子的激活和抑制類受體的信號對靶點進行識別，對靶細胞進行直接殺傷，同時不損傷自身健康細胞。人體NK細胞占血液和其他部位中淋巴細胞的5%-20%，含量豐富，在抗病毒和抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用。NK是控制急性和慢性病毒感染所必需的，同時NK能夠促進多種腫瘤直接裂解，在不同部位巡邏防止轉移。NK細胞功能的多面性顯示出其在免疫介導的保護和內環境穩態平衡中具有動態作用。根據CD56和抗體結合Fc受體CD16的表達水平，人類NK可細分為成熟度和功能...

抗痩素納米抗體制備及篩選

瘦素是一種與能量代謝、免疫、生殖等相關的多功能細胞因子，其在血液中的含量異常會導致肥胖、營養不良、心血管疾病、腫瘤、肝病等多種疾病，特別是終末期腎衰患者廣泛存在瘦素水平過高的問題，由此導致腎衰癥患者營養不良、高血壓、胰島素抵抗等并發癥，這些并發癥嚴重影響了患者的生活質量，因此開發特異性抗體實現瘦素水平的檢測與去除將具有非常重要的臨床意義。納米抗體由于其諸多優良特點，成為該方面研究的選擇。獲得足夠量的抗原是進行抗體篩選的前提，由于血液中瘦素含量較低，進行了瘦素的制備，然后進行抗...